Kan merkezlerinde eritrosit antijen ve antikor reaksiyonlarının
gösterilmesinde RIA (Radioimmun assay) , EIA (Enzymeimmun assay) de
dahil olmak üzere çok sayıda yöntem mevcuttur. Ancak, bu yöntemlerin en
basit olanı aglutinasyon tekniğidir.
Elektrolitli ortamda eritrositlerin yüzeyindeki antijenler, ortamda
bulunan özgül antikorlarla birleşecek olurlarsa, gözle görülebilecek
kümeler oluşturarak çökerler. Bu olaya Hemaglutinasyon denir.
Zeta Potansiyel
Serum fizyolojik içerisinde süspanse edilen eritrositler, birbirlerine
yaklaşık 25 nm uzaklıkta bulunurlar. Bu uzaklık, RBC yüzeyindeki negatif
elektriksel yükün birbirine itmesi ile oluşur. RBC yüzeyindeki negatif
yükün derecesine zeta potansiyel denir. Süspansiyon içindeki katyonlar
(+ yüklü iyonlar, ör: Na+) RBC yüzeyini kuşatırlar ve RBC yüzeyindeki
negatif elektriksel yük ile onu kuşatan katyonların oluşturduğu
potansiyel farkı, kısaca zeta potansiyel diye nitelenebilir.
Hemaglutinasyon Sonuçlarına Etki Eden Faktörler
1. Fiziksel Koşullar
a. İnkübasyon Isısı
IgM tipi antikorlar……….. 4-27 C° (Oda ısısı)
IgG tipi antikorlar ………..30-37 C° (İnkübatör)
b. İnkübasyon Süresi
c. Santrifüj hız ve süresi
d. Ortam: pH, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller
2. Eritrositler
a. Yüzey antijenlerinin sayısı, tipi, lokalizasyonu ve immunojenitesi
b. Homozigot veya heterozigot olmaları
3. Serum
a. Protein İçeriği
b. Antikorların Yapı ve Türleri
Yeni doğanlar ve yetişkinlerin antijenik reaktivitesi farklıdır. A ve B
(Ayrıca P1,Lua, Lub, Yta, Xg ve Vel) antijenlerinin aktivitesi
yetişkinlere göre oldukça düşüktür, ancak Rh (Ayrıca K, Fy, Jk, MNSs,
Di, Do, Sc, Coa, Aua) aktivitesi, doğumda tam gelişmiştir.
Hemaglutinasyonu Kolaylaştıran Faktörler
1. Eritrositler arası mesafeyi kısaltma
a. Proteolitik enzimler: Papain, bromelin, ficin, neuraminidase, tripsin
b. Albumin: Muhtemelen RBC yüzeyindeki negatif elektrik yükü nötralize ederek etki göstermektedir.
c. Polikatyonlar: Polybrene ve protamin gibi polikatyonların eklenmesi
ortamın katyon yoğunluğunu artırır ve RBC yüzeyindeki negatif yükün
nötralizasyonunu sağlar.
d. LISS (Low ionic strength solution) : Ortamdaki ion sayısını azaltır.
e. Santrifüj: Santrifügasyon sırasında RBC’ler birbirlerine yaklaşırlar.
2. İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs Serumu
Yöntemler
Slide Yöntemi
Tüp Yöntemi
Jel Santrifügasyon Yöntemi
Mikroplate Yöntemi
Manual Polybrene Testi
Yarı veya Tam Otomatize Sistemler
Slide Yöntemi
ABO ve RhD antijenlerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasında kullanılır.
Eşit miktarda antiserum ile parmak ucundan alınan kan veya %20’lik
eritrosit süspansiyonu lam veya fayans üzerinde çevirme hareketi ile
karıştırılır. Eritrositlerin kümeler oluşturması, yani aglutinasyon
oluşumu gözlenir. Tepkime yüzeyi geniş olduğundan buharlaşma fazladır.
Bu sebeple 1-2 dakika (max.5 dakika) içinde değerlendirilmelidir.
Tüp Aglutinasyon Testi
Serum fizyolojikle hazırlanan eritrosit süspansiyonu ile antijen bir
tüpte karıştırılır. 1000 rpm devirle 1 dakika santrifüge edildikten
sonra tekrar süspanse edilir ve aglutinasyon değerlendirilir. Bu
değerlendirme mikroskopla veya mercekle yapılabilir. Alternatif olarak
bir damla kan lama alınarak, mikroskopla küçük büyütmede de
incelenebilir. Fiziksel koşullar uygun olarak hazırlandığında, sonuçlar
oldukça güvenilirdir. Buharlaşma sorunu yoktur. İstendiğinde 37 C°’de
1-2 saat inkübe edilebilir. Öte yandan RBC yıkama işlemlerinin fazla
olması nedeniyle kont*****syon olasılığı diğerlerine göre daha fazladır.
Jel Santrifügasyon Yöntemi
Jel testi birçok yönden tüp yöntemine benzer. Testte 5×7 cm büyüklüğünde
plastik kartlar kullanılır. Her kartın üzerinde 6 mikrotüp vardır.
Mikrotüplerin tabanı, değerlendirmeyi kolaylaştırmak için konik; üst
kısmı ise, inkübasyon gerektiren testler için daha geniş olarak
yapılmıştır. Tüplerin içerisinde Sephadex-G 100 maddesini içeren bir jel
vardır. Bu madde başlangıçta toz halindedir; ancak buffer ile
karıştığında jel halini alır. Kartlar için jel hazırlanırken, önce
buffer ile yıkanarak şişmesi sağlanır. Daha sonra da buffer içerisinde
süspansiyonu hazırlanır. Kullanılacağı testin özelliğine göre serum
fizyolojik veya LISS, buffer olarak kullanılır.
Testte zaman ve hız yönünden standardize edilmiş bir santrifüj
kullanılmaktadır. Santrifügasyon işlemi, 70x’de 10 dakika yapılır.
Deneysel çalışmalar, santrifüj ekseninin de önemli olduğunu
göstermiştir. Bu nedenle, eksen santrifüj gücü ile düşey ve yatay planda
tam bir doğru oluşturmaktadır.
Buffer ile yıkama sırasında şişen jel, sadece aglutine olmayan RBC’lerin
geçişine izin verir. Aglutine olmayan eritrositler, santrifüj işlemi
sırasında jel tabakasını geçerek, konik kısımda çökerler. Aglutine olmuş
eritrositler ise üst kısımda kümeler oluştururlar. Kuvvetli
aglutinasyonda çok büyük kümeler oluşur ve jel üzerinde bir tabaka
meydana getirirler. Zayıf aglutinasyonda ise küçük kümeler oluşur ve
reaksiyonun şiddetini değerlendirmek de kolaylaşmış olur.
Mikroplate Yöntemi
Mikroplate yönteminde U veya V tabanlı plastik 96 godeli mikrotitrasyon
plakları kullanılır. Eritrosit süspansiyonu U pleyt için %1-2’lik, V
pleyt için %0,03 konsantrasyonda hazırlanır. 20 µL antiserum ve 20 µL
eritrosit süspansiyonu godeye eklendikten sonra plak, santrifüge edilir.
U pleytler çalkalanıp klasik teknikler gibi değerlendirilirken, V
tabanlı pleytler 75 C°’de 10 dakika inkübe edildikten sonra
değerlendirilir. Düşük konsantrasyonda eritrosit kullanıldığı için diğer
yöntemlerden daha duyarlıdır. Çok az miktarda antiserum kullanıldığı
için daha ekonomik bir metotdur.
Polybrene Yöntemi
Katyonik bir polimer olan polybrene normal eritrositlerde agregasyona
neden olur. Bu agregasyon ortama sodyum sitrat eklendiğinde dağılır.
Eğer eritrositler antikorlarla kaplanmış ise, polybrene eklendiğinde
antikorlar, eritrositler arasında köprü
oluşturarak aglutinasyona neden olur. Bu şekilde oluşan agregasyon,
sodyum sitratla dağılmaz. Polybrene, hem manual hem de otomatik
sistemlerde mikroplate veya tüpte kullanılabilir. Testte yapılacak ilk
işlem, eritrosit yüzeyinin antikorlarla kaplanması için eritrosit
süspansiyonu ile antiserumu inkübe etmektir. Daha sonra ortama polybrene
eklenir. Agregasyon oluşumu izlenir. Santrifügasyon sonrası supernatant
uzaklaştırılır ve ortama trisodyum sitrat-dextroz karışımı eklenerek
aglutinasyon değerlendirilir.
Antiserumların Kalite Kontrolü
Kalite kontrolünde amaç, her işlemi periyodik olarak kontrol ederek
organizasyon hatalarını önlemektir. Anti-A, Anti-B, ve Anti-D için
günümüzde yeni standartlar oluşturulmuştur. Bu standartlar FDA
standartlarıyla eşdeğerdir. Aşağıdaki tablolarda ABO ve Rh
antiserumlarının kalite kontrol standartları belirtilmiştir.
ABO antiserumlarının Kalite Kontrolü
ParametreKalite GereksinimiKontrol SıklığıLaboratuarGörünümHemoliz,
presipitasyon, partiküller ve jel formasyonu görülmemeliHergünGrup
LabReaktivite ve Özgünlükİmmün hemoliz, rülo formasyonu veya prozone
fenomeni olmamalıdır. Uygun antijenlerle kaplanmış eritrositlerle açık
reaksiyona girmeli ve hatalı reaksiyon olmamalıdır.Her yeni serideGrup
LabEtkinlikDilue edilmememiş serum, serum fizyolojikli test tüpünde
%3′lük eritrosit süspansiyonuyla oda ısısında 3-4 pozitif reaksiyon
verebilmelidir. Titrasyon, A1 ve B hücreleri ile Anti-A, Anti-B ve
Anti-AB için 128; A2 ve A2B hücreleri için 64 olmalıdır.Her yeni
serideGrup Lab
kaynak
* Please Don't Spam Here. All the Comments are Reviewed by Admin.